No se sabe nada sobre el origen y la primera parte de la vida de san Eusebio. La historia le menciona por primera vez hacia el año 361, cuando ya era obispo de Samosata y como tal asistió al sínodo convocado en Antioquía para elegir al sucesor del obispo Eudoxio. Precisamente por los esfuerzos del obispo Eusebio, la elección recayó sobre san Melecio, antiguo obispo de Sebaste y un hombre muy venerado por su piedad y sabiduría. Gran parte de los electores eran arrianos y tenían la esperanza de que, si votaban en favor de Melecio, éste favorecería sus doctrinas, por lo menos tácitamente. Pero los arrianos quedaron decepcionados. En el primer discurso que pronunció el nuevo obispo de Antioquía, en presencia del emperador Constancio, que también era arriano, reafirmó la doctrina católica de la Encarnación, tal como había sido expuesta en el Credo de Nicea. A raíz de aquel sermón, los arrianos, enfurecidos, buscaron la manera de deshacerse del obispo y el emperador Constancio envió a uno de sus funcionarios a entrevistar a san Eusebio para pedirle que entregase las actas sinodales de la elección que habían sido confiadas a su cuidado. San Eusebio respondió que no las entregaría sin el previo consentimiento y autorización de todos y cada uno de los signatarios. Se le amenazó con mandar que le cortaran la mano derecha si persistía en su actitud, y entonces el santo extendió sus dos manos y dijo que estaba dispuesto a perderlas, antes que faltar a la confianza que se había depositado en él. El emperador quedó muy impresionado por el valor del obispo y ya no insistió.
Durante algún tiempo más, después de aquel incidente, san Eusebio tomó parte en los concilios y conferencias de los arrianos y semiarrianos, a fin de sostener la verdad y con la esperanza de obtener la unidad; pero, a partir del Concilio de Antioquía, en 363, san Eusebio dejó de aparecer en las reuniones, porque comprendió que su actitud escandalizaba a los ortodoxos. Nueve años después, urgentemente solicitada su presencia por el anciano Gregorio de Nazianzo, fue a Capadocia para ejercer su influencia y su experiencia en favor de san Basilio, en la elección para ocupar la sede vacante de Cesárea. Tan notables fueron los servicios que prestó en aquella ocasión, que el joven Gregorio, en una carta escrita por aquel entonces, se refiere a Eusebio como «columna de la verdad, luz del mundo, instrumento de los favores de Dios hacia su pueblo, apoyo y gloria de toda la ortodoxia». Entre san Basilio y san Eusebio se estableció una sincera amistad que, más tarde, se mantuvo a través de las cartas.
Al estallar la persecución de Valente, san Eusebio, no contento con proteger a sus propios fieles de la herejía, hizo, de incógnito, varias expediciones a Siria y Palestina para fortalecer la fe de los católicos, para ordenar sacerdotes y para ayudar a los obispos ortodoxos a nombrar verdaderos y meritorios pastores que ocuparan las sedes que quedaban vacantes. Su celo extraordinario despertó la animosidad de los arrianos y, en 374, el emperador Valente promulgó la orden que lo condenaba al destierro en Tracia. Cuando el oficial encargado de hacer cumplir el decreto se presentó ante Eusebio, el obispo le rogó que procediera con discreción, porque si el pueblo veía que le arrestaban, se lanzaría sobre los captores para matarlos. Por consiguiente, aquella noche, después de rezar el oficio como de costumbre, salió tranquilamente de su casa cuando todos dormían y, en compañía de uno de sus servidores, partió hacia el Eufrates y se embarcó. A la mañana siguiente, cuando las gentes se dieron cuenta de que había partido, se emprendió su búsqueda; algunos de sus fieles le dieron alcance y le suplicaron, con lágrimas en los ojos, que no los abandonara. Él también lloró ante las muestras de afecto de aquellas gentes, pero les explicó que era necesario obedecer las órdenes del Emperador y los exhortó a confiar en Dios para que todo llegara a arreglarse satisfactoriamente. La grey del obispo Eusebio demostró su fidelidad y, mientras duró el exilio, se negó a tener cualquier trato con los dos prelados arrianos que ocupaban la sede.
A la muerte de Valente, en 378, terminó la persecución, y san Eusebio regresó a su sede y a su rebaño. Su celo y su piedad no habían sufrido menoscabo por los sufrimientos del destierro. Gracias a sus esfuerzos, se restableció en toda su diócesis la unidad católica, y las sedes vecinas fueron ocupadas con prelados ortodoxos. San Eusebio se hallaba de visita en la ciudad de Dolikha, para instalar ahí un obispo católico, cuando una mujer arriana, oculta en la azotea de una casa, le arrojó una pesada piedra sobre la cabeza. El golpe que recibió fue fatal, puesto que, a consecuencias del mismo murió algunos días más tarde, tras de obtener la promesa de sus amigos de que no perseguirían ni castigarían a su atacante.
En el relato que escribieron los bolandistas sobre san Eusebio de Samosata, no incluyeron una biografía propiamente dicha; esa narración se encuentra impresa, en el Acta Sanctorum, junio, vol. V (el 22 de junio), donde también reproducen un cierto capítulo del historiador Tedoreto. Hay una biografía escrita en sirio que reprodujo Bedjan en Acta Martyrum et Sanctorum, vol. VI, pp. 343-349.